ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE

pro znalce

ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE

1. HISTORIE

Elektronový mikroskop je často uváděn, jako příklad typického vynálezu 20. století. K jeho sestrojení nestačila jedna geniální myšlenka, ale cesta k němu vedla přes postupné skládání objevů mnoha badatelů ve spojení s technologickým pokrokem. Jedním ze základních kamenů této mozaiky byl objev elektronu, který popsal J.J. Thompson v roce 1897. Dalším krokem vedoucím k použití elektronů k zobrazení mikrosvěta byl poznatek, který v roce 1925 publikoval Luis de Broglie, že rychle letící částice mají nejen korpuskulární, ale i vlnový charakter jako např. viditelné světlo. Toto potvrdili nezávisle na sobě v roce 1927 Davisson s Germerem a Thompson s Reidem elektronovou difrakcí, která jasně demonstrovala vlnovou povahu elektronů. Důležitou roli na cestě k elektronovému mikroskopu sehrály práce H. Buscha, uveřejněné v roce 1926, které se zabývaly analogií ve vychylování paprsku elektronů pomocí magnetických polí solenoidů a světla skleněnou čočkou.

Konkrétní představa o možnosti zkonstruovat transmisní elektronový mikroskop vznikla pravděpodobně o dva roky později na Vysoké škole technické v Berlíně v kolektivu vedeném Knollem a Ruskou. První mikroskop zkonstruoval tento tým na začátku třicátých let a v roce 1932 se v článku Knolla a Rusky objevily první fotografie z elektronového mikroskopu a popis konstrukce elektromagnetické čočky.

Cesta skanovacího elektronového mikroskopu na svět byla o něco složitější a pomalejší.V roce 1938 německý fyzik M.von Ardenne popsal teoreticky i prakticky princip rastrování u transmisního elektronového mikroskopu. Vlastní skanovací elektronový mikroskop poprvé sestrojil americký vědec Zworikyn, který vynalezl fotonásobič a použil je k detekci

sekundárních elektronů.
Již od počátku vývoje TEM bylo zřejmé, že preparáty připravené k pozorování budou muset být velmi tenké vzhledem k malé penetrační schopnosti elektronového paprsku a navíc zbavené vody z důvodu vysokého vakua v tubusu mikroskopu.

TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP (TEM)

Transmisní elektronový mikroskop je možné popsat jako složité technické zařízení, které umožňuje pozorování preparátů do tloušťky 100 nm při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností. Vzhledem k příbuznosti paprskových diagramů lze jej považovat za analogii světelného mikroskopu v procházejícím světle . Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek. TEM potřebuje ke své činnosti i mnoho dalších systémů, které u světelného mikroskopu nejsou, např. vysokonapěťové zdroje, elektroniku k řízení mikroskopu a výkonný vakuový systém pro vyčerpání jeho vnitřních prostor mikroskopu na hodnotu, která zabezpečí střední volnou dráhu elektronu alespoň v délce 3 m.

Zdrojem záření v elektronovém mikroskopu je žhavené, velmi tenké wolframové vlákno vysílající pod vysokým napětím elektrony. Jejich průběh ve vakuu válcovitého tělesa mikroskopu (tubusu) ve formě lineárního svazku je elektromagneticky usměrňováno, přičemž rotačně symetrická elektromagnetická pole vykonávají v tomto ohledu funkci elektromagnetických čoček. Kondenzor soustředí svazek elektronů na vyšetřovaný objekt pro jeho současně optimální zobrazení na stínítku k subjektivnímu pozorování, ev. snímkování. Osvětlená část vzorku je v dalším zvětšena systémem tvořeným objektivem a projektivem. Elektromagnetická čočka objektivu, která je jednou z nejdůležitějších součástí přístroje, vytváří prvotní zvětšený obraz části objektu v rovině, v níž se uskutečňuje další zvětšení projekčním systémem. Zaostřování obrazu se děje proměnami účinné ohniskové délky elektromagnetických čoček objektivu změnou proudu. Pro přesné zaostření obzvláště při silných zvětšeních je ovšem třeba vícestupňového zařízení o vzrůstající citlivosti. Projekční čočka zobrazuje celkově zvětšený obraz na fosforeskujícím stínítku, které po ozáření elektrony emituje světlo ve viditelné oblasti. Dodatečné zvětšení obrazu při subjektivním pozorování či zaostřování lze dosáhnout přídatnou binokulární lupou. K elektronoptickému vyšetření je třeba vzorky buněk a tkání především stabilizovat fixací, tj. zajistit pokud možno zachování biostruktur a jejich prostorového uspořádání na takové ultrastrukturální úrovni, aby se co nejvíce přiblížila situaci in vivo. Jako nejvhodnější fixativa se osvědčily především glutaraldehyd a oxid osmičelý. Vyšetření vzorku ve vysokém vakuu však vyžaduje dále i jeho vysušení, jakož i další složitou přípravu včetně rozložení do ultratenkých řezů.

SKANOVACÍ(RASTROVACÍ) ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP (SEM)

Skanovací elektronový mikroskop je přístroj určený k pozorování povrchů nejrůznějších objektů. Je ho možné do jisté míry považovat za analogii světelného mikroskopu v dopadajícím světle, na rozdíl od něho je výsledný obraz tvořen pomocí sekundárního signálu - odražených nebo sekundárních elektronů. Díky tomu je zobrazení v SEM považováno za nepřímou metodu. Velkou předností SEM v porovnání se světelným mikroskopem je jeho velká hloubka ostrosti, v důsledku které lze z dvojrozměrných fotografiích ze SEM nalézt jistý trojrozměrný aspekt. Další předností těchto mikroskopů je, že v komoře preparátů vzniká při interakci urychlených elektronů s hmotou vzorku kromě výše zmíněných signálů ještě řada dalších, např. rtg. záření, Augerovy elektrony, katodoluminiscence, které nesou mnoho dalších informací o vzorku. Při jejich detekci je možné určit např. prvkové složení preparátu v dané oblasti a při porovnání s vhodným standardem určit i kvantitativní zastoupení jednotlivých prvků.

Stejně jako v případě TEM ani v SEM většinou nelze biologické materiály prohlížet bez jejich úpravy.

Preparát vhodný pro prohlížení v mikroskopu musí totiž splňovat následující kritéria:
- na jeho povrchu by se neměly vyskytovat cizorodé částice, např. prach
- měl y být stabilní ve vakuu
- stabilitu by měl vykazovat i při ozáření elektronovým paprskem

- měl by produkovat dostatečné množství požadovaného signálu, např. sekundárních elektronů
- při expozici primárním elektronům by nemělo docházet k jeho nabíjení

Některé biologické objekty tyto předpoklady bez problémů splňují, jako např. různé mineralizované struktury, zuby, kosti, schránky rozsivek, ale i rostlinný materiál typu dřevo, pylová zrna apod. Ve většině případů však biologické vzorky obsahují vodu, která z nich musí být před prohlížením odstraněna, což znamená jejich úpravu. Výběr metody závisí na typu preparátu a informacích, které o něm chceme získat. Živočišné tkáně a orgány, rostlinné tkáně představují preparáty, které jsou dosti choulostivé a vyžadují jemné zacházení. Jejich příprava začíná kvalitní fixací(stejná fixativa jak u TEM). Problematické bývá příprava mikroorganismů, jako jsou např. bakterie, prvoci, plankton, především z hlediska manipulace s preparátem. Po každém kroku musí být tyto vzorky centrifugovány, což je nebezpečný zdroj tvarových změn. Východiskem může být jejich přilepení na vhodnou podložku, např. krycí sklíčko, nebo zachycení na filtr, se kterým se pak dále pracuje.

4. VÝHODY EM

Ø Pozorování velmi malých částic (zvětšení až 1000000)

Ø Velké rozlišení (0,1nm)

Ø Velká hloubka ostrosti (několik mm)

Ø Informace o topografii i o materiálovém složení vzorku

5. NEVÝHODY EM

Ø Drahý a prostorově náročný přistroj

Ø Náročná obsluha

Ø Pozorování jen ultratenkých řezů (náročné na přípravu preparátů)

Ø Umístění preparátů ve vakuu znemožňující pozorování živých organismů

6. VYUŽITÍ EM

Ø Lékařství (studium bakterií a virů..)